O cancro cítrico (Xanthomonas axonopodis pv. citri) é uma das mais importantes doenças dos citros e seu controle é feito com medidas de exclusão e erradicação do patógeno. As chances de detecção de plantas doentes diminuem em pomares com baixa incidência da doença. Considerando-se as dificuldades da diagnose visual do cancro cítrico e as vantagens de uma tecnologia que possa melhorar o processo de detecção desta doença no campo, procurou-se identificar características espectroscópicas únicas de uma planta com esta doença. Os objetivos do presente trabalho foram verificar as características espectroscópicas de folhas com cancro cítrico e correlacioná-las às alterações na eficiência fotossintética do tecido foliar doente e relacionar severidade da doença à eficiência fotossintética. Os perfis espectroscópicos e a eficiência fotossintética de plantas das espécies Citrus sinensis ('Hamlin'), Citrus reticulata ('Ponkan') e Citrus limonia ('Cravo') foram avaliados antes e após a inoculação com Xanthomonas axonopodis pv. citri. O modelo y = (1 - x)ß, onde y representa a assimilação líquida relativa de CO₂ (fotossíntese de plantas doentes em relação às testemunhas) e x, a severidade da doença, foi ajustado aos dados por meio de regressão não-linear. O modelo monomolecular foi ajustado à relação entre assimilação líquida relativa de CO₂ e razões espectroscópicas da região do vermelho, também por regressão não-linear. Concluiu-se que a doença afeta a eficiência fotossintética de 'Ponkan' e 'Hamlin'. Em 'Hamlin', a doença não apenas reduz a área foliar, mas também reduz a fotossíntese do tecido verde remanescente. Há relação positiva entre as razões espectroscópicas da região do vermelho e a fotossíntese nas variedades testadas.

A bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Haase) (VAUTERIN et al., 1995) é o agente causal do cancro cítrico asiático, também denominado cancrose A, uma das maiores ameaças à cultura do citros (STALL; SEYMOUR, 1983). É uma das doenças que causam maiores danos econômicos, afetando a citricultura mundialmente, e é motivo para aplicação de leis de quarentena e de erradicação em muitos países (BRUNINGS; GABRIEL, 2003).

No Brasil, especialmente no Estado de São Paulo, em razão de tratar-se de uma doença quarentenária, seu controle exige a adoção de medidas de exclusão e erradicação do patógeno. Por ser o Estado de São Paulo responsável por mais de 90% da produção citrícola nacional, e mais de 95% do volume total exportado (na forma de suco de laranja congelado ou concentrado e frutos in natura), a legislação vigente implica na erradicação parcial ou total de pomares após a detecção de plantas contaminadas.

A incidência da doença é usada como critério de erradicação. A campanha de erradicação, apesar de não ter eliminado totalmente a bactéria do Estado de São Paulo, pode ser considerada como bem sucedida (RODRIGUES NETO et al., 2004), pois mantém a doença em baixo nível de incidência na área nobre da cultura (BARBOSA et al., 2001).

Levantamento amostral, realizado anualmente, revelou que o índice de contaminação por cancro cítrico foi de 0,19% nos talhões de citros avaliados em 2006, ou seja, 99,8% dos talhões de plantas cítricas do Estado de São Paulo e sul do Triângulo Mineiro estão livres da doença (MASSARI; BELASQUE JÚNIOR, 2006).

Inspecionar o pomar rotineiramente é uma das medidas mais importantes para prevenir o cancro cítrico. Este procedimento é realizado por inspetores treinados do Fundo de Defesa da Citricultura (Fundecitrus), os quais vistoriam todas as ruas do pomar, à procura de plantas doentes, através da diagnose visual dos sintomas de cancro cítrico. Entretanto, considerando-se as dificuldades da inspeção do cancro cítrico e o potencial de impacto econômico de uma tecnologia que possa melhorar o processo de detecção desta doença no campo, estudos vêm sendo realizados desde 2002, na tentativa da caracterização espectroscópica de plantas contaminadas por cancro cítrico, de forma a identificar possíveis características espectroscópicas únicas de uma planta com esta doença.

Desta forma, o objetivo do presente trabalho foi identificar alguns dos fenômenos biológicos envolvidos nas respostas obtidas por tecidos vegetais sadios e com cancro cítrico quando excitados por laser. Especificamente, em plantas das espécies Citrus sinensis (L.) Osbeck, Citrus reticulata Blanco e Citrus limonia (L.) Osbeck, procurou-se: (i) verificar as características espectroscópicas de folhas com cancro cítrico e correlacioná-las às alterações na eficiência fotossintética do tecido foliar doente; (ii) relacionar severidade da doença à eficiência fotossintética das folhas.

Os experimentos foram realizados em casa de vegetação localizada no Instituto Biológico, na cidade de Campinas (SP).

Nos experimentos foram utilizadas quinze mudas cítricas, adquiridas de viveiro idôneo, das espécies Citrus sinensis (L.) Osbeck (laranja doce, variedade Hamlin, enxertada sobre limão Cravo), Citrus reticulata Blanco (tangerina, variedade Ponkan, enxertada sobre limão Cravo) e Citrus limonia (L.) Osbeck (limão Cravo), totalizando quarenta e cinco mudas.

Antes da instalação do experimento, as mudas foram transplantadas para vasos plásticos de doze litros preenchidos com solo misturado a substrato, na proporção de 50% de cada componente da mistura. As plantas foram podadas, aproximadamente, dois meses antes da instalação dos experimentos para que as folhas que fossem utilizadas nas avaliações estivessem com a mesma idade na data de inoculação.

As cinco folhas mais novas de cada planta foram inoculadas com suspensão do isolado IBSBF 1421 de Xanthomonas axonopodis pv. citri. Foram realizadas duas repetições do experimento no tempo (experimento 1 e 2), ambos utilizando-se de mesma metodologia e com os mesmos critérios de avaliação.

As inoculações foram por ferimentos com agulhas hipodérmicas, previamente mergulhadas em suspensão bacteriana de 10⁷ ufc/mL e introduzidas no limbo foliar até atravessar toda sua espessura.

Os tratamentos realizados foram: (i) testemunha, que correspondeu a 2 perfurações da agulha mergulhada em tampão PBS (Tampão Fosfato Salino); (ii) severidade média, que correspondeu a 2 perfurações de agulha mergulhada na suspensão bacteriana de 10⁷ ufc/mL; (iii) severidade alta, que correspondeu a 4 perfurações de agulha mergulhada na suspensão bacteriana de 10⁷ ufc/mL. Para a realização das perfurações, as mesmas ficaram delimitadas por moldura com área de 6 cm² de modo que os ferimentos se enquadrassem na área que ficaria dentro da câmara de análise da fotossíntese. Foram utilizadas cinco plantas como repetição de cada tratamento, no delineamento experimental inteiramente casualizado.

Imediatamente após a aplicação dos tratamentos, as plantas foram cobertas com sacos plásticos umedecidos e mantidas nesta condição de câmara úmida durante uma noite, para favorecer a eficácia da inoculação. Após este período, os plásticos foram retirados de cada planta e os experimentos foram conduzidos, cumprindo-se todas as normas de segurança fitossanitária referentes ao cancro cítrico.

Após inoculação, as plantas foram avaliadas diariamente para determinação do período de incubação. Em cada data de avaliação, após o aparecimento dos sintomas, a área de 6 cm² delimitada pela moldura original foi fotografada por uma câmera digital. As imagens digitalizadas foram transferidas para computador e, posteriormente, processadas com o programa de quantificação de doenças QUANT (v.1.0) (VALE; FERNANDES FILHO; LIBERATO, 2003) para a avaliação da severidade dos sintomas nas mesmas. Considerou-se o halo amarelo, freqüentemente encontrado nas folhas, como parte da lesão, ou seja, o mesmo foi considerado no resultado final da severidade.

As avaliações dos parâmetros fisiológicos, taxa líquida de fotossíntese com saturação da luz, taxa de transpiração e taxa de respiração no escuro, foram realizadas com um analisador portátil de gás por infra-vermelho (IRGA), modelo LI-6400 (Li-Cor, EUA ) nas plantas inoculadas e nas testemunhas, sendo avaliada uma folha por planta (Figura 1).

Para a avaliação da fotossíntese e da transpiração, a folha permanecia na câmara de análise por alguns minutos, até a estabilização da leitura. Para a avaliação da Respiração no Escuro a fonte de luz era desligada e o resultado coletado após a estabilização da leitura.

No experimento 1, a primeira avaliação foi realizada um dia antes da inoculação (1 ai), situação em que todas as folhas encontravam-se sadias e sem ferimentos; uma nova avaliação foi realizada um dia após a inoculação (1 dai). As avaliações seguintes foram feitas semanalmente, aos 7 e 13 dias após a inoculação (7 dai e 13 dai, respectivamente). A partir deste ponto, as avaliações tornaram-se quinzenais com leituras realizadas aos 28, 44, 58 e 72 dias após a inoculação (28 dai, 44 dai, 58 dai e 72 dai, respectivamente), finalizando-se este experimento.

No experimento 2, também houve avaliação um dia antes da inoculação (1 ai) e repetiu-se a realizada 1 dai. Porém, diferente do que aconteceu no experimento anterior, as leituras, até o final do experimento, foram aos 9, 16, 21 e 42 dai.

Durante as avaliações, algumas condições foram padronizadas para que as leituras não sofressem qualquer tipo de alteração provocada por fatores que não estivessem relacionados com a doença. Para isto, certas providências foram tomadas, tais como: utilização de "mixer" para injeção de CO₂, mantendo-se constante a concentração de CO₂ no ar que entra na câmara em 380 ppm, aproximadamente e, padronização do fluxo de ar pela câmara em 350µmol s^-1 Com a finalidade de garantir fluxo fotossintético de fótons constante durante as avaliações, utilizou-se fonte de luz artificial do próprio equipamento regulada para 1000 µmol.m^-2.s^-1, deste modo garantindo o ponto de saturação lumínica para as três variedades avaliadas.

Um sistema portátil de espectroscopia de fluorescência (Figura 2) foi o responsável pela coleta de espectros, o qual esteve em operação durante o experimento 2, no qual todas as plantas foram avaliadas (uma folha por planta) quanto às respostas após excitação com laser, com a vantagem de ser uma técnica não destrutiva das amostras. Utilizou-se luz verde como excitação da fluorescência.

A primeira leitura espectroscópica ocorreu um dia antes da inoculação (1 ai), situação em que todas as folhas encontravam-se sadias e sem ferimentos; uma nova leitura foi realizada um dia após a inoculação (1 dai) e as seguintes acompanharam os mesmos dias de avaliação dos parâmetros fisiológicos (9, 16, 21 e 42 dai).

Em cada leitura, os espectros eram coletados em diferentes pontos de folhas com e sem sintomas, coletando-se três espectros por folha avaliada. Os espectros foram coletados nas mesmas folhas em que foram obtidos os resultados com o IRGA, na região de transição entre o tecido amarelo (quando este ocorria na folha) e a região verde, evitando-se direcionar a ponta da fibra para a área que já se encontrava necrosada.

Para fazer a comparação entre as intensidades dos espectros foi necessária padronização do formato dos mesmos, normalizando-os pelo pico da excitação (532 nm) que não foi bloqueado. Assim, todos os espectros estão numa mesma escala, onde o pico da excitação é o mesmo.

Foram utilizadas para comparação as razões RF/ESF e FRF/ESF, onde RF é a fluorescência em 685 nm e FRF a fluorescência em 735 nm e ESF (do inglês, Elastic Scatering Fluorescence, ou seja, Fluorescência do Espalhamento Elástico) representa a normalização do espectro em 532 nm. Portanto, os espectros foram normalizados no pico da excitação (532 nm) para se eliminar possíveis fatores externos como variação da potência do laser, ângulo entre a fibra e a folha, poeira, etc.

O modelo linear foi ajustado aos dados de incremento de severidade da doença (variável dependente) no tempo (variável independente).

O modelo de Bastiaans (1991), y = (1 - x)^ß, onde y representa a assimilação líquida de CO₂ relativa (fotossíntese de plantas doentes em relação às testemunhas) e x representa a severidade da doença, ambos em proporção, e ß representa um parâmetro do modelo, foi ajustado aos dados obtidos nos dois experimentos, através de regressão não-linear pelo método de quadrados mínimos, utilizando-se do programa STATISTICA (StatSoft, Tulsa, EUA). Nas regressões significativas, o parâmetro ß foi comparado a 1 pelo teste t.

O modelo monomolecular y = b1*(1-b2* exp(-b3*x)) (em que y representa a assimilação de CO₂ e x representa as razões RF/ESF e FRF/ESF, b1 representa o valor de estabilização da curva, b2 relaciona-se ao ponto de intercepto da curva e b3 representa o coeficiente da curva) foi ajustado aos dados dos dois experimentos por meio de regressão não-linear.

O aumento na severidade das plantas inoculadas foi linear nas três variedades, em ambos os experimentos e correspondeu à expansão das lesões ao redor dos ferimentos.

No experimento 1, o período de incubação foi atingido ao redor de sete dias após a inoculação para as três variedades, com exceção da severidade média para limão Cravo e Hamlin, nas quais o aparecimento dos sintomas ocorreu, aproximadamente, uma semana depois. Apesar disto, a variedade Hamlin, desde a primeira avaliação, mostrou lesões maiores. Limão Cravo foi sempre mais resistente, em ambos os experimentos, com lesões pequenas e de crescimento lento (0,043 a 0,084 cm/dia).

Nos experimentos 1 e 2, além das lesões necróticas serem mais conspícuas na variedade Hamlin, o halo amarelo foi também maior nesta variedade, seguida da variedade Ponkan e o mesmo não sendo encontrado em folhas de limão Cravo, o qual apresentou as menores severidades.

No experimento 2 o período de incubação para as três variedades, em ambas as severidades, foi atingido ao redor dos 16 dias após a inoculação. Este atraso no aparecimento do sintoma quando comparado ao experimento anterior, possivelmente, deveu-se ao fato das menores temperaturas médias dos dias compreendidos entre a inoculação da bactéria até o aparecimento dos sintomas neste experimento. A severidade máxima obtida ao final do experimento, levando-se em consideração os diferentes tratamentos, não ultrapassou 5%, sendo bastante inferior à encontrada no experimento 1 (aproximadamente 18%).

O modelo proposto por Bastiaans (1991) foi ajustado aos valores de fotossíntese relativa e de severidade da doença obtidos nos experimentos 1 e 2, analisando-se conjuntamente os dados de ambos os experimentos para as variedades Ponkan e Hamlin (Figura 3). As regressões não-lineares foram significativas (p < 0,01) para as variedades citadas anteriormente, apesar dos baixos valores dos coeficientes de determinação (R²) obtidos no ajuste do modelo (Tabela 1). Para estas duas variedades os dados obtidos podem justificar o modelo, ou seja, há diminuição da assimilação líquida de CO₂ (fotossíntese) das folhas doentes com o aumento da severidade da doença e os valores de ß estimados foram, respectivamente, maior e igual a 1 (tese t), para as variedades Hamlin e Ponkan a 5% de probabilidade. No caso da variedade Cravo estas observações não podem ser feitas visto que a mesma apresentou regressão não significativa, ou seja, o modelo não se ajustou aos valores obtidos nas avaliações.

Não houve diferenças entre as espécies no que diz respeito às respostas obtidas pela excitação com o laser e nem se observou diferença evidente entre as diferentes severidades dentro da mesma espécie. Devido a esta igualdade entre as espécies nas respostas ao laser, optou-se pela análise conjunta dos dados, tentando-se correlacionar as leituras obtidas pela excitação da folha com o laser com os valores encontrados de fotossíntese. As razões RF/ESF e FRF/ESF foram relacionadas com a fotossíntese de plantas sadias e doentes. O modelo monomolecular foi ajustado aos dados obtidos neste experimento (Tabela 2 e Figuras 4 e 5). Os ajustes foram significativos (p<0,05).

Nenhum estudo relacionando severidade da doença e fotossíntese foi realizado para o patossistema citros-Xanthomonas axonopodis pv. citri. Pode-se citar alguns entraves para a não concretização destes estudos, entre eles o fato do cancro cítrico ser considerado doença quarentenária e o alto custo na aquisição e manutenção dos equipamentos envolvidos.

Contrariamente às observações de campo, as quais classificam a variedade Ponkan mais resistente ao cancro cítrico que a variedade Cravo (FEICHTENBERGER et al., 2005), observou-se o inverso. Na verdade, as observações deste estudo limitam-se ao crescimento da lesão ao redor do ferimento, que é um dos componentes da resistência varietal. O próprio método de inoculação utilizado permite que se avalie apenas a resistência à colonização, desprezando qualquer barreira imposta pela planta à infecção da bactéria. Não foram avaliados a freqüência de infecção nem o número/extensão de ferimentos em condições naturais. Provavelmente, a grande quantidade de espinhos aliada a uma densidade foliar mediana característica da variedade Cravo fazem com que, em condições de campo, as plantas cítricas desta espécie apresentem elevado número de lesões provenientes do atrito das folhas com os espinhos, resultando na menor resistência desta quando comparada à variedade Ponkan.

O termo lesão virtual abrange a área da lesão visual mais uma área adjacente na qual a atividade fotossintética também é afetada pela atividade do patógeno. O conceito de lesão virtual proposto por Bastiaans (1991) foi a base para um modelo que quantifica a capacidade fotossintética de folhas doentes. A relação entre a severidade da doença e a fotossíntese das folhas infectadas é descrita por um único parâmetro ß (BASSANEZI, 2000). Pelos resultados obtidos nos experimentos 1 e 2 a variedade Ponkan apresentou valor de ß igual a 1 e a variedade Hamlin, valor de ß maior que 1, indicando decréscimo na taxa fotossintética destas duas variedades com o aumento da severidade da doença. Na variedade Hamlin a diminuição da taxa fotossintética foi proporcionalmente maior que área afetada pela doença, mostrando a existência de lesão virtual. Na variedade Cravo o modelo não se ajustou aos valores obtidos nas avaliações, uma vez que para esta variedade, em ambos os experimentos, as severidades não alcançaram valores expressivos fazendo com que esta obtivesse a menor expansão da lesão ao redor do ferimento em relação às outras variedades avaliadas.

Nos níveis de severidade estudados, as medidas espectroscópicas (razão RF/ESF e FRF/ESF) têm relação positiva significativa com os valores de fotossíntese. O modelo monomolecular ajustou-se melhor aos dados que o modelo linear e, aparentemente, tem relação com o conteúdo de clorofila presente nas folhas visto que, a fluorescência emitida na região do vermelho depende principalmente da concentração de clorofila na folha, porque somente ela emite nessa região (CEROVIC et al., 1999; LINS, 2005). Os menores valores de fotossíntese se relacionam com os menores valores de RF/ESF e FRF/ESF, provavelmente devido ao menor conteúdo de clorofila nestas amostras, causando uma diminuição na fluorescência emitida. À medida que ocorre aumento no conteúdo de clorofila das folhas, a fotossíntese também aumenta e o sistema de espectroscopia de fluorescência lê estes incrementos mostrando valores de RF/ESF e FRF/ESF maiores. A fotossíntese atinge seu máximo e se estabiliza, mas o sistema de espectroscopia continua com leituras crescentes de RF/ESF e FRF/ESF. Portanto, o sistema portátil de espectroscopia é capaz de realizar leituras que se relacionam diretamente com a fotossíntese das folhas, porém, esta relação só é verdadeira até certo ponto, a partir do qual o mesmo continua captando intensidades de fluorescência maiores (RF/ESF e FRF/ESF maiores), embora as folhas estejam com sua atividade fotossintética constante. É importante ressaltar a grande variação nas leituras de espectroscopia de fluorescência, possivelmente explicadas pela variação na idade das folhas avaliadas, diferentes dias de leitura e que, ao contrário do equipamento IRGA que mede a fotossíntese de uma área de 6 cm², o sistema de espectroscopia faz leituras pontuais na folha.

A relação das leituras de espectroscopia de fluorescência com a fotossíntese sugere que doenças que afetam o conteúdo de clorofila da folha não poderão ser diferenciadas com base nestas razões estudadas, uma vez que as mesmas apresentarão alterações semelhantes. De fato, Marcassa et al. (2006) não conseguiram diferenciar acuradamente folhas com sintomas de cancro cítrico e clorose variegada dos citros (CVC). No entanto, esses mesmos autores conseguiram distinguir amostras representadas por folhas com e sem sintomas de cancro cítrico. Provavelmente, em razão da relação existente entre a espectroscopia de fluorescência, da forma como testada, e a fotossíntese, resultados mais promissores serão obtidos na comparação de plantas com e sem estresses, e não com plantas sob diferentes tipos de estresses.

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